В современных лабораториях контаминации часто играют ключевую роль в снижении качества и достоверности результатов исследования. Попадание биологических, химических или физических примесей в образцы, оборудование, расходные материалы или на рабочие поверхности приводит к ложноположительным или ложноотрицательным результатам, что в свою очередь может навредить исследованию и потребовать повторных анализов, а при невозможности обнаружить источник загрязнения — к большим финансовым затратам на очистку лабораторных приборов и замену реактивов. В условиях проведения высокоточных исследований (ПЦР, секвенирование и т. д.) даже минимальный уровень загрязнения становится критическим.

Особую проблему создают перекрестные контаминации между образцами и зонами, а в некоторых случаях между лабораториями, работающими с одинаковыми образцами [1]. Именно поэтому создание общей базы для возможности диагностирования контаминации станет крайне полезным для уменьшения финансовых затрат. Ведь при обнаружении источника загрязнения устранить его будет намного легче.

ВИДЫ КОНТАМИНАЦИЙ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ

Загрязнения клеточных культур можно разделить на две основные категории: химические (примеси в средах, сыворотках и воде, эндотоксины и т. д.) и биологические загрязнения (бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, микоплазмы и загрязнение другими клеточными линиями). Обширное перекрестное заражение многих клеточных культур клетками HeLa и другими быстрорастущими клеточными линиями является четко установленной проблемой с серьезными последствиями. Одними из возможных контаминантов являются дрожжи и плесень. Их обнаружение возможно с помощью визуального осмотра и/или микробиологического посева [2].

Микоплазменная инфекция клеточных культур — повсеместно распространенное явление, обусловливающее основные патологические эффекты в клеточной физиологии и метаболизме. Из-за малых размеров микоплазм, медленного роста и особенностей патогенеза вызванной ими инфекцией (в частности, отсутствует повреждение эукариотических клеток) загрязнение клеточных линий микоплазмами сложно детектировать при помощи световой микроскопии, как это характерно для других бактериальных контаминаций. Чаще всего контаминацию определяют по ухудшению состояния клеточной культуры, изменению ее состояния и поведения клеток [3, 4].

Для детекции микоплазм используются полимеразная цепная реакция, иммуноокрашивания, авторадиографии, микробиологические исследования, электронная микроскопия. В последнее время разрабатывают различные флуоресцентные красители для оптимизации детекции микоплазм, однако вопрос соотношения скорости детекции и стоимости используемых методов остается открытым [5, 6].

Для лечения микоплазмозов используют антибиотики (макролиды, хинолоны). Их назначают с учетом чувствительности к ним возбудителя. Антибиотикотерапию же назначают в случае выявления облигатно-патогенного вида — Mycoplasma genitalium. Для условно-патогенных микоплазм диагностически значимым является выявление возбудителя в концентрации 104 и более микробных клеток в 1 мл материала [7].

Вирусные контаминации сложно выявить, так как эти микроскопические инфекционные агенты являются внутриклеточными паразитами, которые используют механизмы клеток хозяина для размножения, а их чрезвычайно малый размер делает их очень сложными для детектирования и удаления их из реагентов. Использование зараженных вирусом клеточных культур может представлять серьезную опасность для дальнейших исследований и здоровья персонала, работающего в лаборатории, особенно если матрицей для клеточных культур являлись клетки человека или приматов [1, 2].

В отличие от микоплазменной контаминации, которая характерна для всех видов клеточных линий, заражение вирусами специфично и зависит от типа клеточной линии. Так, например, вирус мышиного гепатита характерен только для мышиных клеточных линий (Neuro-2a, RAW 264.7), а вирус Тейлера — для клеток нейробластомы мыши (Neuro-2a) [8–10]. Однако существуют вирусы, контаминирующие подавляющее большинство клеточных культур, представленных в лаборатории. В работе 2024 г. рассматривался один из таких вирусов — BVDV (Bovine Viral Diarrhea Virus), который при попадании в лабораторию заражает как клеточные линии человека, так и мышиные [11]. Поэтому стратегия диагностики вирусной контаминации индивидуальна и будет отличаться у разных лабораторий.

В качестве терапии против вирусных контаминаций могут использоваться: противовирусные препараты, в том числе ингибиторы обратной транскриптазы [12]. Помимо этого, возможно использовать иммунонейтрализацию или лимитирующие разведения [13, :lit_ 14;]. Однако очистка зараженных клеточных линий практически никогда не проводится из-за рисков безопасности. Намного проще утилизировать культуру автоклавированием и использовать новую матрицу. Очистка оправдана только для уникальных гибридов или незаменимых первичных линий.

Из-за этого возникает проблема: при утилизации зараженного материала вероятны большие денежные потери, потому что далеко не всегда понятен источник заражения, что ведет к необходимости избавляться от большинства расходников. Для избежания этой ситуации и сокращения денежных затрат разумно использовать диагностикум для разделения загрязненных и чистых культур. Из-за особенности вирусных инфекций возникает необходимость в пересмотре стратегии диагностики контаминации материалов лабораторий в рамках крупных институтов.

ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ЛАБОРАТОРНОГО ДИАГНОСТИКУМА

На сегодняшний момент остро стоит вопрос не только в выборе методов детекции контаминантов, но и в импортозамещении зарубежных тест-систем на российские. Из имеющихся на рынке наборов по детекции контаминантов лишь около 7% производится в РФ (их число не превышает 50), тогда как в одной только Германии производится свыше 250 видов тест-систем для детекции контаминантов (анализ проведен в рамках проектной деятельности Университетской школы Хим*Био*Плюс). Именно поэтому создание подобного диагностикума крайне актуально для российского рынка. Оценка (рис. 1) трудозатрат при постановке реакций, чувствительности и специфичности диагностикумов для вирусных и микоплазменных контаминаций, а также соотнесение этих показателей со стоимостью таких наборов указывает на то, что для крупных организаций оптимально определять контаминации с помощью ПЦР.

Алгоритм (рис. 2) подтверждения и определения типа контаминации должен включать как ПЦР, так и микроскопирование (для исключения загрязнения культуры грибковой инфекцией). Если работа ведется в рамках одной лаборатории, то при появлении новых клеточных линий необходимо будет изменять спектр детектируемых вирусов.

Однако для крупных исследовательских структур, включающих несколько независимых лабораторий, изолированный подход к биобезопасности оказывается несостоятельным. Высокая интенсивность обмена биоматериалами, а также использование общего оборудования и человеческий фактор создают угрозу скрытого распространения контаминаций. В этих условиях локальный мониторинг необходимо заменить на сквозной общий протокол контроля, а информацию о фиксации того или иного патогена необходимо сделать доступной для всей структуры. Переход от ситуативного устранения заражения к превентивному управлению биологическими рисками требует создания единого алгоритма детекции контаминаций и своевременного осведомления о возникших контаминациях внутри других лабораторий.

ЕДИНАЯ ИНФОРМАЦИОННАЯ БАЗА КАК КЛЮЧЕВОЙ ИНСТРУМЕНТ

Создание общего ПЦР-диагностикума предполагает также централизацию ключевых этапов: пробоподготовку, постановку реакций, амплификацию и анализ результатов. В публикациях на эту тему отмечается, что эффективное зонирование и односторонний поток проб — ключевые условия снижения риска переноса загрязнения. В рамках института это требует разработки единого регламента движения материала, исключающего перемещение образцов из «грязных» зон в «чистые» [15]. Такой регламент позволит снизить вероятность получения ложноположительных результатов, которые чаще всего появляются из-за контаминации продуктами амплификации и перекрестной контаминации, а также могут быть связаны с отсутствием контроля над процессами ингибирования реакций и экстракцией [16–18]. Для увеличения точности необходимы не только строгие стандарты контроля, но и создание общего лабораторного диагностикума, как для одной лаборатории, так и для ряда лабораторий внутри одного института.

Кроме того, при создании объединенного диагностикума необходимо учитывать различия в локальных протоколах и уровнях подготовки персонала. В работе по управлению инцидентами контаминации подчеркивается, что стандартизация обучений, регулярная ревизия и аудиты являются не менее важными, чем технические решения. Важно, чтобы единый ПЦР-диагностикум обеспечивал не только аналитическую службу, но и методическую и консультационную поддержку лабораториям института, способствуя гармонизации подходов и повышению культуры качества [19].

В исследованиях проблем контаминации и управлению качеством анализов в лабораториях показано, что систематическая регистрация и анализ ошибок позволяют выявлять повторяющиеся проблемы, что ведет к оптимизации процедур и предотвращению их повторения. В условиях института единая база будет выступать в качестве основы для обмена информацией между лабораториями, что приведет к исправлению повторяющихся проблем, а также снизит финансовую нагрузку, необходимую для решения проблем (рис. 3).

Таким образом, единая информационная база, встроенная в структуру общего обмена данными, становится не просто архивом. Она трансформируется в базовый элемент системы управления качеством и центральный узел методической координации институтских лабораторий. Объединение и централизация информационных потоков в рамках единой цифровой системы позволяет реализовать сквозной контроль на всех этапах работы с биоматериалами.

Внедрение подобной системы обеспечит непрерывную верификацию биологических агентов и потенциальных контаминантов. Систематическая проверка и оценка приобретают критическое значение в условиях, когда ложные результаты и перекрестные контаминации выходят за рамки локальной проблемы. Распространяясь через обмен образцами и совместное использование оборудования, подобные ошибки приобретают накопительный эффект.

В масштабах института они трансформируются в системные разрушительные факторы, способные критически снизить надежность научных и клинических данных.

В конечном счете единая информационная база выступает фундаментом, который не просто фиксирует текущий статус исследований, но и предотвращает каскадное распространение биологически опасных агентов, обеспечивая безопасность и достоверность исследований.