Современный уровень понимания сложности и многогранности механизмов взаимодействия «пациент– лекарство» обусловливает необходимость тщательного и многофакторного анализа фармацевтических и биологических факторов, влияющих на биодоступность, фармакокинетику и фармакодинамику лекарственных средств. Состав препарата, технология его производства и состояние биологических барьеров пациента — все эти факторы, как по отдельности, так и в совокупности, могут существенно изменить или исказить желаемый фармакологический результат. Это значительно увеличивает объем, трудоемкость, экономические и временные затраты на проведение исследований новых и дженериковых препаратов. В ответ на эти вызовы все большую актуальность приобретает фармакокинетический подход к оценке биодоступности и биоэквивалентности [1], расширяется спектр и повышается точность исследований in vitro, что позволяет существенно сократить затраты и продолжительность предварительных исследований биодоступности и биоэквивалентности, а в некоторых случаях (например, при регистрации дженериков) даже стать основным или единственным методом установления биоэквивалентности [2, 3]. Одной из ключевых групп in vitro-методов является тест на проникновение in vitro (IVPT).

Цель данного мини-обзора — описать современное состояние применения тестов IVPT для оценки трансдермальной проницаемости, ограничения их применения, а также определить ключевые пути оптимизации и повышения актуальности этих систем.

Тест на проникновение in vitro (IVPT) представляет собой чувствительную и надежную модельную систему, которая сыграла ключевую роль в выявлении фундаментальных параметров, связанных с всасыванием как лекарственных препаратов, так и промышленных химикатов через различные биологические барьеры [4].

В течение последних нескольких десятилетий IVPT с использованием тканей животных или клеточных культур in vitro применялся в качестве экономичного и эффективного инструмента для оценки высвобождения и проникновения лекарственных средств, способствуя разработке рецептур и контролю качества систем пероральной, трансмукозальной и трансдермальной доставки лекарственных средств [5].

Для оценки трансдермальной проницаемости используются различные системы IVPT. В качестве модельных мембран чаще всего используются образцы кожи человека или животных (особенно свиней). В отличие от большинства клинических методов тестирования биоэквивалентности, метод IVPT позволяет одновременно оценивать несколько повторений (участков кожи) от одного и того же донора («испытуемого»). Наиболее часто используемые методы IVPT включают вертикальную диффузионную камеру, проточную диффузионную камеру, камеру Уссинга и системы Transwell [5].

Несомненным преимуществом IVPT является его высокая чувствительность, превосходящая чувствительность исследований in vivo. В частности, было показано, что IVPT значительно более чувствителен и менее изменчив, чем вазоконстрикторный тест [6].

Это позволяет проводить гораздо более дифференцированную оценку сходств и различий между препаратами для местного применения. Описано исследование, в котором IVPT продемонстрировал преимущество в оценке биоэквивалентности по сравнению с клиническим методом [7].

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ IVPT И ИССЛЕДОВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДАННОГО ТЕСТА

В настоящее время тест IVPT широко применяется в качестве ключевого или одного из основных тестов для определения биоэквивалентности и включается в программы разработки фармацевтических препаратов для наружного применения c местным и системным действием [8].

В настоящее время в научной литературе описаны исследования с использованием различных модификаций IVPT для широкого спектра препаратов для наружного применения. IVPT с использованием образцов кожи человека в диффузионных камерах Франца применялся для подтверждения эффективности проникновения активного ингредиента при трансдермальной заместительной гормональной терапии для облегчения нежелательных симптомов менопаузы [9–11]. В другом исследовании IVPT использовался для оценки степени проникновения через кожный барьер молекул инсулина, включенных в запатентованную фосфолипидную основу, предназначенную для доставки высокомолекулярных АФИ [12]. Также описано исследование трансдермальной проницаемости лоразепама с использованием кожи туловища человека и камер Франца [13]. Применение IVPT позволило дифференцированно оценить механизм распределения препарата в коже и характер его всасывания и, таким образом, подобрать оптимальную основу для препарата трамадола для наружного применения [14]. Также описано исследование с использованием метода IVPT для изучения проникновения УФ-абсорбера в солнцезащитном креме [15].

Таким образом, в настоящее время метод IVPT успешно применяется как для системных, так и для местных препаратов. Благодаря своей чувствительности и воспроизводимости этот метод был включен в нормативные документы FDA и EMA в качестве теста для оценки биоэквивалентности местных препаратов [2, 5, 16].

ОГРАНИЧЕНИЯ И ПРОБЛЕМЫ ПРИМЕНЕНИЯ IVPT

В то же время ряд исследователей указывает на ограничения данного теста и необходимость в некоторых случаях с осторожностью интерпретировать его результаты.

Так, отмечается, что любой образец кожи одного и того же донора может демонстрировать необычный или аномальный профиль абсорбции. Результаты исследований с такими образцами часто называют «выпадающими значениями», поскольку они демонстрируют значительное отличие в кинетике трансдермальной абсорбции по сравнению с другими образцами [4].

Другое исследование было посвящено выбору и предварительному тестированию участков кожи человека для IVPT. Руководства FDA и ОЭСР по IVPT рекомендуют проверять каждый участок кожи, выбранный для тестирования, перед использованием, чтобы убедиться в сохранности рогового слоя. В настоящее время приемлемыми считаются три метода:
1) трансэпидермальная потеря воды (TEWL),
2) электрическое сопротивление
3) абсорбция тритиевой воды.

Пол, раса и возраст кожи также имеют значение (более проницаемая: кожа мужчин, кожа чернокожих, образцы кожи, полученные от пожилых доноров) [3].

Это также подтверждает утверждение о том, что использование кожи человека в качестве мембраны затрудняется ограниченным доступом, высокой вариабельностью результатов и ограниченной применимостью для препаратов с низкой кожной проницаемостью [17].

Корреляция между моделями IVPT in vitro и in vivo была убедительно продемонстрирована для системной доставки, однако существуют некоторые споры относительно способности данного теста надежно выявлять небольшие изменения при местной доставке в различные области кожи, что является критически важной задачей для оценки препаратов местного применения [18]. Результаты комплексной обработки биометрических данных в опубликованном исследовании показали, что эквивалентность in vitro не может быть достигнута во всех областях кожи ни для оригинального препарата, ни для дженерика. Кроме того, авторы ставят под сомнение необходимость отрицательного контроля, предложенного в проекте руководства EMA [2].

Ряд авторов также указывают на недостаточное изучение влияния внешних факторов во время проведения IVPT, которые могут оказывать значительное воздействие на результаты. Среди наиболее часто упоминаемых факторов — влияние температуры. В частности, было показано, что модификация IVPT, проводимая при повышенных температурах и основанная на дизайне клинических испытаний, в большей степени согласуется с результатами клинических испытаний трансдермальной системы бупренорфина [19]. В исследовании также описывается комбинированный IVPT диклофенака с использованием кожи одной миниатюрной свиньи и кожи трех доноров-людей при температурах 32 ± 1 °C и 42 ± 1 °C для моделирования нормальной и повышенной температуры кожи соответственно. Результаты показали, что воздействие тепла может изменять степень проникновения препарата из препаратов для местного применения; однако, как и ожидалось, повышение его концентрации не приведет к достижению системных концентраций, вызывающих опасения [20].

В другом исследовании трансдермальных систем (ТТС) с никотином и фентанилом в ходе IVPT изучалось воздействие как постоянного, так и прерывистого нагрева, при котором тепло подавалось либо в течение максимального рекомендуемого срока ношения ТТС, либо в течение коротких промежутков времени. Исследование продемонстрировало значимость температурных эффектов, однако для точной интерпретации результатов необходимы дальнейшие клинические исследования [21].

МЕТОДЫ ПОВЫШЕНИЯ ТОЧНОСТИ И НАДЕЖНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ IVPT

Помимо температурного фактора, ряд других условий, связанных как с влиянием внешней среды эксперимента, так и с используемыми в эксперименте материалами, может приводить к неверным, иногда аномальным результатам. В последние годы исследователи сосредоточили свои усилия на внедрении различных методов, направленных на повышение надежности и релевантности методологии IVPT и интерпретации ее результатов.

Одним из наиболее распространенных подходов, описанных в научной литературе, является использование IVPT в сочетании с другим суррогатным методом in vitro или с фармакодинамической оценкой in vivo. Выявление корреляции in vitro/in vivo (IVIVC) имеет большое значение при разработке биофармацевтических препаратов, поскольку после разработки и валидации модели метод in vitro можно использовать для эффективной оценки и прогнозирования характеристик лекарственного препарата in vivo. Опубликованное исследование показало, что влияние тепла на повышение биодоступности фентанила, наблюдаемое in vivo, было более выраженным, чем в условиях in vitro. Таким образом, исследователи пришли к выводу, что, хотя IVPT может быть полезным инструментом для оценки эффективности ТТС фентанила in vivo с относительно хорошей предсказуемостью в условиях нормальной температуры и для сравнения влияния тепла на доставку лекарственного средства из ТТС различных рецептур, дополнительные меры тестирования улучшили бы способность предсказывать эффекты тепла in vivo с меньшей погрешностью прогнозирования [22]. В другом исследовании предлагается дополнить и подтвердить результаты, полученные при IVPT, результатами метода обратного ионтофореза. Для проверки полученных данных использовался метод вазоконстрикции. Использование комбинации методов продемонстрировало высокую степень сходимости результатов [23]. В другом исследовании была предпринята попытка связать in vivo фармакокинетические профили концентраций в плазме во времени после местного применения лекарственных средств с результатами IVPT с использованием механистических диффузионных и компартментных моделей. Результатом этой работы стало предположение, что механистические и физиологически обоснованные фармакокинетические модели на основе данных IVPT могут использоваться для прогнозирования поведения in vivo средств для местного применения [24].

Перспективным представляется дополнение тестирования IVPT моделью физиологической фармакокинетики при кожном введении, которая обеспечивает механистический подход для более точной интерпретации результатов IVPT и экстраполяции данных in vitro на in vivo [25].

Еще одним распространенным подходом к повышению точности и надежности результатов IVPT является оптимизация обработки и интерпретации данных, полученных в ходе тестирования. Например, применение нового статистического подхода к оценке результатов тестирования биоэквивалентности кремов ацикловира продемонстрировало, что IVPT является чувствительным и дискриминационным тестом, способным выявлять различия в скорости и степени биодоступности ацикловира в коже при использовании кремов с различными составами [26]. В опубликованном исследовании предлагается модель масштабирования для статистической обработки данных IVPT, которая демонстрирует способность выявлять значимые различия между перспективным дженериком (испытуемым препаратом) и эталонным стандартом, показывая более высокую чувствительность по сравнению с тестами без масштабирования. Кроме того, для достижения адекватной статистической мощности требуются меньшие размеры выборок [27].

Ряд авторов предлагают математические модели, разработанные на основе данных IVPT, которые позволяют прогнозировать скорость и степень всасывания препарата при любом количестве приемов в день и в течение нескольких дней. Таким образом, авторы предлагают решение актуальной проблемы проведения IVPT и интерпретации результатов при тестировании многократного применения препарата [28]. Одним из способов повышения значимости результатов IVPT может стать метод статистической проверки гипотез, а именно смешанная масштабированная средняя биоэквивалентность (MSABE). Включение MSABE в адаптивный дизайн, модификации адаптивных методов, используемых в исследованиях биоэквивалентности IVPT, такие как поправка Бонферрони и функция условной мощности, демонстрируют преимущества таких адаптивных методов [29]. Опубликованное исследование также демонстрирует эффективность построения корреляций между результатами IVPT и in vivo-испытаниями путем обработки данных, включающей этапы деконволюции и свертки [30].

Ряд исследователей стремится оптимизировать процесс IVPT и сэкономить ресурсы за счет досрочного прекращения неперспективных экспериментов с помощью алгоритма раннего принятия решений [31]. Кроме того, предлагается использовать моделирование результатов IVPT с помощью трансдермального модуля GastroPlus 9.7, который обычно используется для прогнозирования фармакокинетических параметров при трансдермальном пути введения [32].

Еще одним примером использования моделирования IVPT и прогнозирования результатов является исследование с применением восходящего мультифизического моделирования, в ходе которого была продемонстрирована возможность оценки механизма кинетики абсорбции через кожу гетерогенных препаратов для местного применения [33]. Кроме того, исследователи подчеркивают важность выбора подходящих биоаналитических методов и процедур [34] и предлагают варианты оптимизации и автоматизации отбора проб в ходе IVPT [35].

В некоторых случаях IVPT модернизируется и адаптируется путем замены биологических мембран на искусственные. Безусловным преимуществом искусственных мембран является однородность и предсказуемость их свойств, а также минимальная вариабельность. Модели реконструированного эпидермиса человека были валидированы в качестве суррогатов кожи для испытаний на безопасность и исследовались для тестирования трансдермальной абсорбции с использованием дискриминантного и модифицированного теста на проницаемость in vitro (IVPT). Результаты показали более высокую проницаемость реконструированного эпидермиса, что потенциально позволяет проводить более дифференцированные сравнения профилей проникновения продукта [17]. В другом опубликованном исследовании были протестированы режимы IVPT с использованием различных синтетических мембран (гидрофильный полиамидный нейлон, полисульфон Tuffrin и мембрана STRAT-M (SM)) и различных типов принимающей среды (фосфатный буфер, содержащий различные концентрации лаурилсульфата натрия). Корреляции in vitro-in vivo были установлены с помощью программного обеспечения GastroPlus. Наилучший метод IVPT был выбран на основе установления двухточечной корреляции с данными in vivo с минимальными ошибками прогнозирования (%PE) AUC0-24 и Cmax. Результаты показали, что метод IVPT, в котором использовалась диффузионная система с диффузионной ячейкой Франца, мембраной SM и фосфатным буфером без поверхностно-активного вещества, позволил построить наилучшую модель IVIVR с коэффициентом корреляции (R2) 0,9966 и экспоненциальной функцией Y = (1,35)5 × X3,6 [36].

В то же время необходимо учитывать тот факт, что использование синтетических мембран не позволяет оценить индивидуальные различия в проницаемости кожи, взятой из разных участков и от разных доноров. Эта информация, при надлежащей обработке, представляет интерес и может быть систематизирована для лучшего понимания реальных случаев аномальной проницаемости [4].

Многообещающим направлением адаптации IVPT является разработка двухслойной (роговой слой с жизнеспособным эпидермисом) диффузионной модели с соответствующим математическим и статистическим аппаратом для обработки результатов [37].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, можно утверждать, что на сегодняшний день IVPT широко и успешно используется в мировой практике для оценки всасывания наружно применяемых лекарственных средств. Как и любая модель или метод, IVPT не лишен недостатков и ограничений, однако растущее осознание этих ограничений позволяет учитывать их при планировании эксперимента и интерпретации результатов. Кроме того, в последние годы большое количество исследований было посвящено различным способам повышения эффективности этого метода. В целом можно выделить несколько основных направлений модификации и модернизации метода IVPT:
- оптимизация методов обработки и интерпретации результатов — сбор дополнительной информации, использование новых методов обработки данных;
- оптимизация за счет использования накопленных данных о корреляции методов IVIVT для создания прогнозных математических моделей и алгоритмов обработки данных;
- техническая оптимизация — физическая модификация существующих тестовых систем, повышение их сложности, приближение модели к реальным условиям кожи.

Можно предположить, что дополнительные пути развития систем IVPT будут включать усложнение структуры тестовых систем, введение дополнительных режимов тестирования и функциональное объединение IVPT с двухкомпонентной моделью.