При разработке аналитических методик и тестов растворения для малорастворимых фармацевтических субстанций задача подбора приемлемой среды растворения без добавления ПАВ встречается часто. Для чистых, зарегистрированных субстанций нередко доступны рекомендованные неводные растворители и методики количественного определения; однако в пилотных исследованиях и на этапах разработки требуется работать с водными средами из-за биофармацевтических соображений или технологических ограничений.

Апрепитант выбран в качестве модельного вещества ввиду его низкой растворимости в воде: в литературе отмечается растворимость порядка 3–7 мкг/мл в диапазоне pH 2–10 и резкий рост растворимости при pH 1 (порядка 130 мкг/мл при pH 1,0). В in vitro-исследованиях отмечены значения растворимости 15,6 мкг/мл (pH 1,2), 0,79 мкг/мл (pH 4,5) и < 0,3 мкг/мл (pH 6,8–7,4). Даже в присутствии ПАВ (PBS pH 6,6 + 0,1% SDS) растворение остается ограниченным [1–3]. Эти особенности делают апрепитант удобной моделью для изучения эффектов, возникающих при переводе веществ в водные среды и при их последующей подготовке к анализу.

Цель исследования — сформулировать практические критерии и рекомендации при выборе водной среды и методов подготовки проб (включая фильтрацию), минимизирующие систематическую потерю аналитического сигнала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Апрепитант (чистота 99,6%, Fuxin Long Rui Pharmaceutical Co., Ltd., Китай). Вода очищенная, полученная на лабораторном аквадистилляторе. Этанол 95%. Одноразовые шприцы 10 мл. Шприцевые мембранные фильтры различных материалов и пор: PES 13 мм 0,45 мкм, PVDF 25 мм 0,45 мкм, Nylon (NY) 13 мм 0,22 мкм, Polypropylene (PP) 13 мм 0,45 мкм. Все фильтры гидрофильные.

Приготовление растворов. Растворы апрепитанта готовили разбавлением аликвот спиртового концентрата (апрепитант в этаноле 95%) очищенной водой до целевых концентраций. Итоговое содержание органической фазы в растворах составляло менее 1%. Анализировались свежеприготовленные растворы без фильтрации, а также после фильтрации через различные шприцевые фильтры. Для контроля стабильности части пробы измеряли спектрофотометром в динамике времени. Первые 2 мл после фильтрации отбрасывались, если это не фракционный сбор.

Инструментальные методы. Спектры поглощения регистрировали с помощью двухлучевого УФ-видимого спектрофотометра UV-2600 (Shimadzu Corp., Япония) с кварцевыми кюветами толщиной 1 см. Измерения проводили в диапазоне 185–500 нм с шагом 0,2 нм (в кювете сравнения — соответствующая среда растворения). Сбор и первичную обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения UVProbe (версия 2.42, Shimadzu). Линейность и остальные ключевые параметры проверялись в области, близкой к фактическим рабочим концентрациям.

Взвешивание образцов проводилось на аналитических весах Pioneer PA214 (Ohaus Corporation, США) с дискретностью 0,1 мг и среднеквадратическим отклонением (воспроизводимостью) 0,1 мг.

Калибровка и расчет потерь. Калибровочная зависимость получена методом прямой линии y = a·x + b, где y — оптическая плотность (OD) при 210 нм, x — концентрация (мкг/мл). Потеря вещества при фильтрации рассчитывалась как:

Формула 1

Экспериментальные наблюдения. Проводились серии измерений с различными исходными концентрациями и с последовательной фильтрацией (фракционный отбор через одну и ту же мембрану), а также эксперименты в кислой среде (0,1 М HCl) для сравнения поведения растворимости и устойчивости растворов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Калибровочная кривая

Калибровочная зависимость из данных (табл. 1): y = 0,02983·x + 0,01318, R2 = 0,99541. (В отдельной серии измерений получена альтернативная аппроксимация y = 0,0273·x + 0,0097, R2 = 0,9999 — данные использовались для расчета концентраций некоторых контрольных растворов.)

Влияние фильтрации и материала мембраны

Исследование показало, что фильтрация водных растворов апрепитанта через мембраны различных материалов (PES, PP, Nylon, PVDF) приводит к значительным и трудно прогнозируемым потерям аналитического сигнала. Величина потерь варьировала в широком диапазоне от 15 до 84% в зависимости от начальной концентрации и типа полимера. Сводные данные экспериментальных серий представлены в (табл. 2).

Ни один из исследованных материалов не обеспечил полной инертности по отношению к апрепитанту в водной среде. Наиболее критичные потери наблюдались на мембранах PES при высоких концентрациях (до 84%) и Nylon (до 59%). Высокая вариабельность результатов (RSD контрольных растворов до 7,5%) указывает на то, что процесс не ограничивается простой адсорбцией.

Динамика при последовательной фильтрации (фракционная фильтрация)

При последовательной фильтрации одной пробы (фракциями по 10 мл) были выявлены принципиальные различия в поведении материалов (рисунок).

Для мембран PES характерен классический профиль насыщения адсорбционных центров: потери снижались от 38% в первой фракции до 10% в третьей. Однако в четвертой фракции зафиксирован аномальный рост концентрации (+20% к исходному уровню), что свидетельствует о десорбции накопленного вещества или срыве адсорбционного слоя при изменении гидродинамики потока.

В отличие от этого, фильтрация через PVDF продемонстрировала хаотичную вариабельность потерь (23–39%) без выраженного тренда на насыщение, что сопровождалось общим снижением стабильности раствора во времени.

Роль механически индуцированной нуклеации

Ряд экспериментов подтвердил гипотезу о том, что потери обусловлены не только адсорбцией, но и переходом растворенного вещества в твердую фазу под действием механического стресса.

1. Эффект механического воздействия: пропускание раствора через шприц без фильтра приводило к появлению фонового сигнала в области 500 нм. Это доказывает, что само давление и турбулентность провоцируют нуклеацию (образование зародышей кристаллов) из пересыщенного раствора.
2. Сдвиг спектра: в пересыщенных растворах (36,8 мкг/мл) зафиксировано одновременное падение пика поглощения (210 нм) и рост рассеяния света в длинноволновой области (300–500 нм), что подтверждает образование взвешенных частиц.
3. Фильтр как центр кристаллизации: при попытке фильтрации пересыщенных растворов мембрана выступала инициатором гетерогенной нуклеации, что приводило к полному удалению вещества из фильтрата, в отличие от прозрачных растворов.

Эксперименты в кислой среде (0,1 M HCl) показали, что апрепитант в протонированной форме образовал стабильный истинный раствор, без выраженных эффектов кристаллизации и адсорбции (потери при фильтрации для растворов 17,9 мкг/мл и 91,12 мкг/мл составили 1,6% и 0,7% соответственно).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами данные коррелируют с исследованиями, указывающими на то, что мембранная фильтрация является критическим этапом пробоподготовки, способным существенно искажать результаты количественного анализа. В частности, при исследовании равновесной растворимости фармацевтических субстанций ввели понятие «эффекта искажения фильтром» (distortion effect of filter, DEF), показав, что адсорбция на мембране может приводить к непрогнозируемым ошибкам [4]. Наши результаты подтверждают этот тезис для апрепитанта.

Анализ полученных данных, по-видимому, выявил два процесса, снижающих аналитический сигнал.

1. Адсорбция на полимерной матрице. Как и в похожих работах [5], мы наблюдали зависимость потерь от гидрофобности материала. Высокие потери на PES и Nylon согласуются с данными [6], которые признали эти материалы проблематичными для гидрофобных аналитов, рекомендуя PTFE как более инертную альтернативу. Эффект насыщения мембраны, зафиксированный нами при фракционной фильтрации, также описан в литературе для других классов соединений.
2. Индуцированная гетерогенная нуклеация. Это, по-видимому, является доминирующим фактором для пересыщенных растворов апрепитанта. В отличие от чистой адсорбции, описанной для истинных растворов, мы наблюдали рост оптической плотности в неаналитической области (300–500 нм) и резкое падение концентрации после механического воздействия. Мы предполагаем, что микропористая структура фильтра и сдвиговое напряжение при прохождении через поры служат триггерами фазового перехода. Это объясняет, почему потери могут превышать 80% — фильтр не просто сорбирует молекулы, а инициирует лавинообразную кристаллизацию всей пробы.

Использование кислой среды (0,1 M HCl) устранило проблему, переводя апрепитант в ионизированную и более растворимую форму. Это согласуется с принципами, описанными в работе [7], где pH среды и ионная сила называются ключевыми факторами управления сорбцией. Можно также отметить, что во многих исследованиях и в нормативной документации на апрепитант используют подкисленную подвижную фазу при использовании ВЭЖХ.

ВЫВОДЫ

Цель исследования была достигнута: определены критические факторы пробоподготовки, влияющие на валидность анализа апрепитанта.
Основным механизмом потерь апрепитанта в нейтральных водных средах является не только адсорбция, но и механически и поверхностно индуцированная нуклеация на мембране.
Гипотеза для будущих исследований: мы предполагаем, что введение этапа «стресс-тестирования фильтрации» (сравнение центрифугирования и фильтрации при разных условиях) может стать частью валидации методик для препаратов с низкой растворимостью.
Практическое применение: в практике следует отдавать приоритет центрифугированию. Если фильтрация неизбежна, необходимо валидировать не только материал фильтра, но и объем преднасыщения, рассматривая фильтр как расходный материал с определенной «емкостью» искажения (DEF). Наиболее эффективным методом стабилизации пробы является перевод вещества в истинный раствор путем протонирования (использование кислой среды), что нивелирует влияние материала фильтра.