Сиднонимины представляют собой класс химических соединений, перспективный для разработки новых лекарственных средств [1]. Известно, что данные вещества обладают противовоспалительной, жаропонижающей [2] и противоопухолевой [3, 4] активностью, являются ингибиторами моноаминооксидазы [5, 6], оказывают спазмолитический эффект [1]. Однако сиднонимины более известны как донаторы оксида азота, обладающие вазодилатирующей активностью [7]. Наиболее известным препаратом данной группы является молсидомин, в настоящее время применяемый в качестве антиангинального средства [8]. Еще один представитель данной группы соединений — лекарственный кандидат пирсидомин (и его гидролизированная форма — дарсидомин) [9], обладающий сосудорасширяющей активностью, не прошел вторую фазу клинических испытаний и в настоящее время не применяется [2]. Также известно применение препаратов сиднониминов в качестве психостимуляторов. Представителями данной фармакологической группы являются мезокарб и его активный энантиомер — армезокарб, а также препарат фепросиднин [10].

Установленная сосудорасширяющая активность сиднониминов позволяет рассматривать данные вещества в качестве соединений-лидеров на ранних этапах разработки средств для коррекции нарушений мозгового кровообращения. Выбор соединений данной химической группы также обусловлен наличием нейропротективного эффекта, связанного с увеличением содержания глутатиона в тканях головного мозга [11] или стимуляцией растворимой гуанилатциклазой с последующим накоплением цГМФ [12]. Для реализации церебральной вазодилатирующей активности в сочетании с отсутствием выраженного влияния на системную гемодинамику требуется оптимизация соединений-лидеров по пути взаимодействия со специфическими мишенями в структурах центральной нервной системы (ЦНС) или улучшения фармакокинетических свойств молекул, позволяющих достичь более высоких значений концентраций в тканях ЦНС [13, 14]. Учитывая механизм реализации сосудорасширяющей активности сиднониминов, связанный с самопроизвольным высвобождением оксида азота при физиологических значениях pH плазмы крови и не требующий взаимодействия со специфической мишенью, фармакокинетический подход в оптимизации соединений-лидеров данной химической группы является наиболее приемлемым. Принимая во внимание тот факт, что ткани ЦНС отличаются высокой липофильностью, повышение гидрофобности молекул фармакологически активных веществ будет способствовать более выраженному их распределению в структуры головного мозга и замедлению элиминации.

Оптимизация соединений-лидеров группы сиднониминов с целью повышения их липофильности может быть осуществлена путем введения в структуру молекулы различных гидрофобных радикалов. Последующее проведение экспериментальных фармакокинетических исследований, включая оценку распределения соединений-лидеров между плазмой крови и тканями головного мозга, позволит выявить оптимальное соединение-лидер, которое в дальнейшем может рассматриваться в качестве перспективного лекарственного кандидата для фармакологической коррекции нарушений мозгового кровообращения.

Цель настоящего исследования — оптимизация соединений-лидеров группы сиднониминов для получения лекарственного кандидата с преимущественной церебральной вазодилатирующей активностью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез соединений-лидеров группы сиднониминов осуществлен в научно-исследовательской лаборатории химии лекарственных субстанций НИИ трансляционной медицины, ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздрава России. Фармакологическая и биоаналитическая части эксперимента были выполнены на базе НПЦ фармацевтических и биоаналитических исследований ФГБОУ ВО Тверского ГМУ Минздрава России.

Объектом исследования явились соединения, являющиеся производными N-(этоксикарбонил) сиднонимина с различными заместителями у 3-го атома 1,2,3-оксадиазола (табл. 1).

Для изучения накопления соединений-лидеров в структурах центральной нервной системы был выполнен фармакологический эксперимент на крысах, целью которого явилась сравнительная оцнка концентрации того или иного вещества в плазме крови и тканях головного мозга после однократного внутрижелудочного введения с последующим вычислением коэффициентов межтканевого распределения.

Исследования были выполнены на 65 крысах Wistar мужского пола массой около 300 г (питомник ООО «СМК СТЕЗАР», Россия). Клетки с животными находились в контролируемых условиях окружающей среды (20– 26 °C и 30–70% относительная влажность). В комнатах содержания животных поддерживался 12-часовой цикл освещения и 8–10-кратная смена объема воздуха в час. Крыс кормили полнорационным комбикормом ПК-120 (ООО «Лабораторкорм»), поили фильтрованной водопроводной водой ad libitum. Чистка клеток, влажная уборка комнат, а также замена бутылок с водой на новые осуществлялась ежедневно. Вечером накануне эксперимента животные были лишены корма.

Из активных фармацевтических субстанций (АФС) исследуемых соединений-лидеров в выпарной колбе была приготовлена смесь, содержащая по 270 мкмоль каждого вещества. Дополнительно в состав комбинации была введена АФС молсидомина в эквивалентном количестве. Полученная смесь была количественно перенесена в мерную колбу объемом 10 мл и растворена в диметилсульфоксиде. Аликвота (926 мкл) полученного комбинированного раствора (индивидуальная концентрация каждого вещества 27 мкмоль/мл) перенесена в мерную колбу вместимостью 50 мл и растворена в кукурузном масле. Комбинированный масляный раствор (0,5 мкмоль/мл) был использован для приготовления 10% эмульсии кукурузного масла в воде, с индивидуальной концентрацией каждого соединения 0,05 мкмоль/мл. Полученную эмульсию вводили подопытным крысам однократно внутрижелудочно с помощью одноразового шприца, снабженного зондом, из расчета 5 мл на 300 г массы тела. Индивидуальные дозы комбинированного препарата были определены после предварительного взвешивания крыс и обеспечены изменением вводимого объема эмульсии. Таким образом, индивидуальная доза каждого соединения для крыс составила 0,82 мкмоль/кг, что эквивалентно однократному применению молсидомина у человека в стандартной дозе 2 мг.

Животных выводили из эксперимента путем декапитации с помощью гильотины (Open Science) в следующих временных точках от момента введения эмульсии: 7,5; 15; 30; 45; 60; 90 минут; 2; 4; 6; 8; 12 и 24 часа, кроме этого дополнительно использовали группу интактных крыс (точка 0 часов). На каждую временную точку приходилось по 5 крыс. Во время проведения декапитации отбирали кровь в объеме 2 мл в полипропиленовые пробирки, содержащие К2ЭДТА, интенсивно перемешивали покачиванием, после чего немедленно отделяли плазму центрифугированием при 3500 об./мин в течение 10 мин с помощью лабораторной центрифуги LMC-4200R (Biosan, Латвия). Аликвоту плазмы объемом 100 мкл объединяли с 400 мкл раствора внутреннего стандарта (IS, N-(этоксикарбонил)-3-(4-метилпентан-2-ил)сиднонимин, 100 нг/мл) в метаноле с добавлением 0,1% муравьиной кислоты, смешивали на вортексе Microspin FV-2400 (Biosan, Латвия) в течение 30 секунд и помещали в морозильную камеру.

После забора крови немедленно проводили извлечение головного мозга, который промывали в физиологическом растворе, обсушивали фильтровальной бумагой, разделяли на две части по продольной щели. Половину мозга помещали в предварительно взвешенную на аналитических весах пробирку Эппендорфа объемом 2 мл. Определяли массу фрагмента путем повторного взвешивания заполненной пробирки. Немедленно добавляли 0,1% водный раствор муравьиной кислоты из расчета на 100 мг ткани — 400 мкл. В пробирку добавляли бусину из кварцевого стекла и подвергали обработке с помощью гомогенизатора Minilys (Bertin Technologies, Франция) в два подхода по 2 минуты. Пробоподготовку полученных гомогенатов осуществляли аналогично плазме крови.

Гомогенаты головного мозга, плазму крови и готовые экстракты хранили до анализа при температуре –40˚С в морозильной камере MDF-136 (Sanyo, Япония). В биоаналитической лаборатории надосадочную жидкость отделяли с помощью центрифуги ЕВА 400Р (EAC, Россия) при ускорении 21 000 g и температуре –10 °С в течение 20 мин, 50 мкл супернатанта переносили в одноразовые полиэтиленовые вставки в хроматографические виалы и помещали в автосамплер хроматографа.

Для количественного определения соединений-лидеров группы сиднонимина в плазме крови и гомогенатах головного мозга была разработана и валидирована биоаналитическая ВЭЖХ–МС/МС методика. Разделение исследуемых веществ проводили на колонке Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4,6 × 100 мм, 2,7 мкм с предколонкой Phenomenex C18 4,0 × 3 мм, элюирование осуществляли смесью деионизированной воды и ацетонитрила с добавлением 0,1% муравьиной кислоты в градиентном режиме. Хроматографирование выполняли с помощью ВЭЖХ Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies, Германия), детектирование осуществляли с использованием квадрупольного масс-спектрометра Sciex QTrap 3200 MD (AB Sciex, Сингапур) в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) при положительной ионизации. Концентрации аналитов были рассчитаны с помощью ПО Analyst 1.6.3 (AB Sciex) по калибровочным графикам зависимости площади хроматографического пика аналита, нормированной на площадь IS, от номинальной концентрации аналита.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе разработки биоаналитической методики для всех аналитов и внутреннего стандарта были выбраны по два фрагментарных иона, для которых была выполнена оптимизация параметров, обеспечивающих наилучшую чувствительность анализа (табл. 2). Масс-спектры ионов- продуктов определяемых веществ представлены на рис. 1.

Хроматографическое разделение осуществляли на колонке Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 4,6 × 100 мм, 2,7 мкм в сочетании с предколонкой Phenomenex C18 4,0 x 3 мм 0,1% раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле и деионизированной воде в градиентном режиме при скорости потока 0,6 мл/мин (табл. 3). На рис. 2 представлена общая хроматограмма стандартного образца плазмы крови крыс с индивидуальной концентрацией каждого исследуемого соединения 0,2 нмоль/мл.

После проведения пробоподготовки образцы плазмы крови и гомогенатов головного мозга крыс были проанализированы в отдельных аналитических сериях. Каждая серия включала в себя холостой образец (не содержащий исследуемые соединения и внутренний стандарт), нулевой образец (содержащий только внутренний стандарт), калибровочные образцы, образцы контроля качества в 4 уровнях концентраций и исследуемые образцы. Концентрации соединений группы сиднонимина были рассчитаны по калибровочной зависимости площади хроматографического пика аналита, нормированной на площадь внутреннего стандарта, от номинальной концентрации аналита. Для построения калибровочных кривых использовали линейную регрессию. Контроль точности и прецизионности (CV%) анализа в каждой аналитической серии был осуществлен с помощью образцов контроля качества. Отклонения от номинальной концентрации аналитов и СV% между повторными инжекциями калибровочных и контрольных образцов были в пределах 15% на всех уровнях концентраций, что демонстрировало приемлемость аналитической серии.

По усредненным результатам количественного определения соединений группы сиднониминов в биоматериале были построены фармакокинетические кривые в плазме крови (рис. 3) и тканях головного мозга крыс (рис. 4).

Для сравнительной оценки проникновения исследуемых соединений в структуры головного мозга крыс были рассчитаны коэффициенты межтканевого распределения (Kd) как отношение индивидуальной концентрации каждого вещества в тканях головного мозга к концентрации в плазме крови. Данный показатель был рассчитан для всех животных в каждой временной точке, на основании индивидуальных значений Kd были вычислены средние значения показателя в каждую временную точку после исключения выбросов, обнаруженных с помощью статистического теста Граббса (рис. 5).

Кроме этого, были рассчитаны усредненные значения Kd «головной мозг/плазма крови» для каждого изучаемого соединения группы сиднониминов по всем временным точкам (рис. 6).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

По результатам фармакокинетических исследований установлено, что для всех изучаемых соединений группы сиднониминов время достижения максимальной концентрации (Tmax) в плазме крови крыс составляет 15 минут. Отсутствие достоверных различий данного показателя между исследуемыми соединениями, вероятно, обусловлено применяемой лекарственной формой (масляной эмульсией), обеспечивающей быстрое поступление в системный кровоток из желудочно-кишечного тракта как липофильных, так и гидрофильных веществ. Кроме того, для всех веществ наблюдается наличие второго пика концентрации в плазме крови, соответствующего 90 минутам, что объясняется установленной по результатам ранее проведенных исследований [15] энтерогепатической циркуляцией. Наибольшие значения максимальной концентрации (Cmax) в плазме крови установлены для соединений, имеющих в составе радикалы: 4-морфолинил (молсидомин), этил (925), 3-метокси-пропил (935). Наименьшие значения Cmax наблюдаются для сиднониминов, в строении которых имеются радикалы: децил (933), октил (934), 4-метилгексан-2-ил (BBP2023).

Сравнительный анализ фармакокинетических кривых исследуемых соединений группы сиднониминов в тканях головного мозга крыс показывает наличие выраженных различий. Так, для веществ: BBP2023, 933, 934 значение Tmax составляет в среднем 45 минут, для остальных соединений — 15 минут. Кроме того, для BBP2023, 933 и 934 наблюдаются более плавные нарастание и падение концентрации в тканях головного мозга.

Сравнительная оценка усредненных значений коэффициентов межтканевого распределения «головной мозг/плазма крови» показывает наличие достоверных различий данного показателя у вышеперечисленных соединений и молсидомина (рис. 6). Данный факт свидетельствует об относительном преобладании соединений BBP2023, 933, 934 в структурах центральной нервной системы по сравнению с плазмой крови на протяжении времени наблюдения.

Кроме того, прослеживается прямая зависимость увеличения среднего значения Kd «головной мозг/ плазма крови» от количества углеводородных групп в составе радикала у 3-го атома 1,2,3-оксадиазола в структуре исследуемых веществ. Данный факт соотносится с поведением соединений при проведении хроматографического анализа методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 2). Таким образом, увеличение гидрофобности соединений группы сиднониминов за счет введения в их структуру углеводородного радикала способствует более выраженному распределению данных веществ в структуры головного мозга, что является важным при разработке средств фармакологической коррекции нарушений мозгового кровообращения.

ВЫВОДЫ

Среди изученных веществ группы сиднониминов наибольший интерес представляет соединение-лидер с лабораторным шифром BBP2023. Проведенные дополнительные исследования биотрансформации позволили установить, что одним из метаболитов BBP2023 является 1,3-диметиламиламин (геранамин), являющийся соединением с установленной психостимулирующей активностью [16]. Данный факт может быть полезен при терапии нарушений мозгового кровообращения, сопровождающихся угнетением центральной нервной системы.

Выбранное соединение-лидер обладает экспериментально подтвержденной церебральной вазодилатирующей активностью, имеет оптимальный фармакокинетический профиль в тканях головного мозга, а также характеризуется наличием плейотропных эффектов (прокогнитивный, психостимулирующий), что делает его перспективным лекарственным кандидатом, рекомендуемым для дальнейших расширенных доклинических исследований эффективности и безопасности.