Производные урацила — пиримидинового нуклеинового основания, входящего в состав рибонуклеиновых кислот, — на протяжении десятилетий остаются одним из наиболее плодотворных классов соединений для медицинской химии. Химическая платформа этой молекулы предоставляет уникальные возможности для тонкой настройки биологической активности, поскольку сочетает в себе способность к многообразию таутомерных превращений, богатство координационной химии и синтетическую доступность для направленной функционализации практически в любом  положении гетероциклического ядра [1]. Именно эти особенности делают урациловый скаффолд идеальной отправной точкой для создания новых терапевтических агентов, мишень-ориентированный дизайн которых требует глубокого понимания взаимосвязи «структура–активность» на молекулярном уровне.

Среди многообразия нуклеиновых пиримидиновых оснований урацил и его производные занимают особое место, которое определяется не только фундаментальной ролью в биохимических процессах, но и широким спектром фармакологических активностей. На сегодняшний день для этого класса соединений обнаружены антимикробная, акарицидная, анальгетическая, выраженные противовоспалительная и противораковая активности [2–7].

Широкое терапевтическое применение нашли как природные пиримидины, так и их синтетические аналоги (рис. 1). Эра противораковой и противовирусной химиотерапии началась с клинического внедрения галогенированных производных урацила: идоксуридина (1), первый противовирусный препарат для местного применения при герпетических кератитах) и цитарабина (2), остающегося до настоящего времени ключевым агентом в схемах лечения острых лейкозов, механизм действия которого связан с ингибированием ДНК-полимеразы.

Особую веху в истории противоопухолевой терапии составило открытие антиметаболитов пиримидинового обмена, в первую очередь фторированных аналогов. Наиболее широко изученными и вошедшими в стандарты клинической практики являются фторурацил (3) и его нуклеозидное пролекарство флоксуридин (4), механизм цитотоксичности которых реализуется путем ингибирования тимидилатсинтазы и последующего включения в нуклеиновые кислоты (рис. 1). Успех этих препаратов в онкологической практике стимулирует непрерывный поиск новых, более эффективных и селективных аналогов, способных преодолевать лекарственную резистентность, обладающих улучшенным профилем безопасности [8].

Отметим также, что пиримидиновый скаффолд может выполнять не только роль фармакофора, но и вектора для адресной доставки биологически активного фрагмента к специфическим мишеням. В частности, использование урацила как узнающего элемента позволило создать мощные ингибиторы человеческой карбоангидразы (hCA), показав, что корректный дизайн способен обеспечить высокое сродство и селективность по отношению к определенным изоформам фермента [9].

В контексте поиска структур с новым профилем биологической активности особого внимания заслуживает зависимость физико-химических свойств и, как следствие, фармакологического поведения производных урацила от их способности к таутомерным и конформационным переходам. Урацил способен существовать в виде нескольких таутомерных форм: трех лактам-лактимных таутомеров (U1–3), различающихся положением экзоциклических гидроксильных групп, а также диенольной формы (U4); кроме того, за счет вращения гидроксилов относительно связи C–O [10] возможны различные ротамерные состояния (U5,6) (рис. 2).

С применением спектроскопии диспергированной флуоресценции в сверхзвуковых струях были надежно идентифицированы дикето- (U1) и кето-енольные (U2, U3) таутомеры [11]. Отметим, что точная структура последнего длительное время оставалась предметом многочисленных дискуссий.

Согласно калориметрическим экспериментам и теоретическим оценкам, проведенным ранее, доминирующей в газовой фазе и малополярных средах является дикето-форма U1. Диенольный таутомер U4 менее стабилен, чем U1, на 20 ± 10 ккал/моль, а кето-енольный таутомер U3 — на 19 ± 6 ккал/моль [12].

Ранее с использованием методов квантовой химии (теория функционала плотности, B97-D3/aug-cc-pVDZ с моделированием десяти различных по полярности сред (1 < ε < 10⁹) в рамках поляризуемой континуальной модели сольватации (PCM)), было показано, что сами по себе эффекты сольватации, а также введение в положение С (5) таких сильных донорно-акцепторных заместителей, как нитро- и аминогруппа, принципиально не изменяют таутомерные предпочтения урацила по сравнению с незамещенным гетероциклом [10]. Однако существенное влияние на относительную стабильность таутомеров способны оказывать специфические внутримолекулярные взаимодействия. Так, образование сильной внутримолекулярной водородной связи NO⋅⋅⋅HO в 5-нитропроизводном стабилизирует диенольный таутомер, снижая его относительную энергию с 17.9 ккал/моль (в отсутствие такой связи, рис. 2) до 5.4 ккал/моль относительно наиболее стабильного дикето-таутомера.

Ранее в рамках систематического исследования кремнийорганических соединений нами была предложена стратегия синтеза N-сульфоалкилированных производных урацилов, основанная на реакции 1,3-пропансультона с соответствующими N-силилированными урацилами (рис. 4) [13]. Данный подход открыл удобный путь к цвиттер-ионным структурам 5 и 6, содержащим сульфопропильный фрагмент, способный влиять на физико-химические и фармакокинетические свойства молекулы (растворимость и способность к межмолекулярным взаимодействиям) (рис. 3).

Настоящая работа является продолжением наших исследований, направленных на поиск оригинальных соединений с доказанной активностью в отношении заболеваний центральной нервной системы (ЦНС). Сфокусированность на патологиях ЦНС — ишемическом инсульте, нейродегенеративных заболеваниях (болезни Паркинсона и Альцгеймера), тревожно-депрессивных расстройствах — продиктована как острой неудовлетворенной медицинской потребностью, так и накопленными нами экспериментальными данными о способности ранее синтезированных сульфоалкилированных гетероциклов проявлять нейропротекторные и ноотропные свойства [14–20].

Поскольку фармакологический ответ на вводимое вещество является сложной функцией его химического строения, включающей не только композиционную (брутто-состав), конституционную (последовательность связей), но и конфигурационную и конформационную составляющие, установление корреляций между пространственной структурой соединения и его биологической активностью становится ключевой исследовательской задачей в медицинской химии.

Таким образом, целью настоящего исследования стало комплексное изучение структурных особенностей (включая таутомерный состав и конформационное поведение) как ранее синтезированных N-сульфопропилированных производных урацила (7–13), так и не полученных в настоящее время, но потенциально перспективных с точки зрения медицинского применения 5- и 6-аминопроизводных урацила в конденсированной фазе (14–16), а также проведение скрининговой оценки возможной биологической активности in silico соединений 7–16 и их таутомерных форм. Полученные данные позволят выбрать потенциальные соединения — лидеры для их последующего изучения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Трехмерные структуры таутомеров сгенерированы из рисунков 1 и 5 с помощью программы OpenBabel [21]. Для каждого из них, затем, с помощью программы CREST 3.0.2 [22] был выполнен конформационный поиск методом GFN2-xtb для определения наиболее оптимального расположения атомов с точки зрения полной энергии. Далее, для полученных структур конформеров проведена оптимизация геометрии и расчет термодинамических параметров при 298 K c помощью композитного метода ωB97X-3c, обеспечивающего достаточно высокий уровень результатов при умеренных вычислительных затратах и встроенного в программу Orca 6.1.0 [23]. В данном методе для описания полной энергии используется meta-GGA функционал ωB97X [24] с учетом дальнодействия (range-separated). Для описания валентных электронов использован базисный набор vDZP (дубль-зета), учет остовных электронов выполнен с помощью псевдопотенциала, за вклад дисперсионных взаимодействий отвечает поправка D4 [25]. Влияние растворителя описывалось с помощью модели CPCM (поляризуемого диэлектрического континуума).

Для прогноза спектра биологической активности исследуемых соединений была использована программа PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) версия 2024 г. [26]. Анализ прогноза спектра биологической активности исследуемых соединений был проведен в программе PharmaExpert (версия 2024) [27]. PASS 2024 предсказывает 9274 активности со средней точностью прогноза AUC рассчитанной по процедуре скользящего контроля с исключением по одному 0,929. Спектр прогнозируемой биологической активности включает 575 фармакологических эффектов, 5422 механизма действия, 160 активностей, связанных с действием на антимишени, 226 терминов, связанных с взаимодействием соединений с ферментами метаболизма. Прогноз был выполнен с порогом Pa>0,3.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для изучения стабильности и установления корреляции «структура — биологическая активность» (QSAR) были выбраны 36 структур всех возможных таутомеров для соединений 7–16 (рис. 5), строение которых представлено ниже.

Результаты проведенного комплексного исследования представлены ниже.

Квантовохимическое исследование

В табл. 1 суммированы рассчитанные значения полной энергии, термодинамические параметры исследованных соединений 7–16 и их таутомерных форм, а также таутомерных форм урацила (U1–6) (рис. 1, рис. 5).
Как видно из представленных данных, во всех случаях, в т. ч. для урацила, наибольшей устойчивостью обладает таутомер а с двумя кето- группами (табл. 1). Следующим по стабильности идет таутомер b с гидроксильной группой в 4 положении, а кето- группой в 6 положении. Полученные результаты коррелируют с ранее опубликованными для таутомерных форм урацила [10].

Изучение биологической активности in silico

Полученные результаты in silico (QSAR) показывают, что исследованные соединения могут проявлять ряд фармакологических эффектов. В качестве примера для дикето-таутомеров а в таблице 2 представлены некоторые наиболее характерные данные о спрогнозированных:
1) фармакологических эффектах и связанных с ними механизмах действия (связь между эффектами и механизмами показана дополнительным отступом) с порогом Pa>0,3 (колонка эффекты);
2) молекулярных механизмов действия с порогом Pa>0.5 (колонка механизм);
3) прогноз терминов, связанных с взаимодействием соединений с ферментами метаболизма с порогом Pa>0.5 (колонка метаболизм); прогноз терминов, связанных с действием на антимишени с порогом Pa>0.3 (колонка антимишени) Рассмотрим в убывающем порядке по вероятности те эффекты, для которых предсказываются также и механизмы действия, так как такая комбинация повышает в целом вероятность экспериментального подтверждения предсказанного эффекта.

С наибольшей вероятностью прогнозируется противовирусная активность (Antiviral), в том числе в отношении ВИЧ Antiviral (HIV). Дополнительно в пользу высокой вероятности ее экспериментального подтверждения свидетельствует прогнозируемый для нее механизм действия (DNA directed DNA polymerase inhibitor), хотя и меньшей по сравнению с самим эффектом вероятностью.

Наиболее выражено прогнозируемая комбинация противовирусной активности и ингибирования ДНК-направленной ДНК-полимеразы представлена у таутомеров соединения 8: у всех рассчитанных таутомеров наблюдается высокая вероятность противовирусной активности (Pa>0.75) и ингибирования ДНК-направленной ДНК-полимеразы (Pa>0.45). Для таутомеров серии 14 прогнозируется наименьшая вероятность данной комбинации. В большинстве случаев у таутомеров а и с вероятность выше, чем для таутомеров b. В серии 10 вероятность ингибирования ДНК-направленной ДНК-полимеразы ниже порога прогноза в Pa>0.3. Несмотря на высокую вероятность противовирусной активности у соединений 12b, c, вероятность ингибирования ДНК-направленной ДНК-полимеразы также ниже порога прогноза в Pa>0.3. Для ряда таутомеров соединения 15 характерно наличие высокого прогноза проявления противирусной активности (Pa>0.6), особенно это выражено для таутомеров а (Pa=0,733), а для ДНК-направленной ДНК-полимеразы — для а и с (Pa=0.550 и Pa=0.617, соответственно). Отметим, что для таутомера 9b данный вид активности оказался маловероятен (Pa>0.3). Для серии 16, таутомер d показывает самую низкую вероятность проявления противовирусной активности (Pa=0.547) и ингибирования ДНК-направленной ДНК-полимеразы (Pa=0.398).

Перспективным направлением биологических исследований также может стать противобактериальная активность (Antibacterial), особенно при вирусных заболеваниях глаз (Antibacterial, ophthalmic), а также против бактерий, вызывающих туберкулез (Antituberculosic). В качестве механизмов действия, связанных с этими эффектами, прогнозируются ингибирования синтеза клеточной стенки (Cell wall synthesis inhibitor) и ингибирование гиалуронатлиазы (Hyaluronate lyase inhibitor). Как эффекты, так и механизмы прогнозируются примерно равновероятно по всем сериям со средней вероятностью эффектов в интервале Pa от 0.4 до 0.6, а механизмы — в интервале Pa от 0.3 до 0.4.

Также у многих соединений прогнозируется противоишемическая активность (Antiischemic), в том числе против ишемии миокарда (Myocardial ischemia treatment). В качестве механизма действия прогнозируется гепариноподобная активность (Heparin and LMW heparins). Чаще всего противоишемическая активность в отношении миокарда прогнозируется у таутомеров соединений 7, 9 и 14 в интервале Pa от 0.3 до 0.4. Общий антиишемический эффект прогнозируется у большинства соединений в интервале Pa от 0.3 до 0.5. Гепариноподобная активность также прогнозируется у большинства таутомеров, за исключением таутомеров соединений 15, 16, в интервале Pa от 0.3 до 0.5.

Предсказаны и другие эффекты с механизмами действия, заслуживающие внимания:

1. Противоопухолевая активность в отношении разных типов опухолей и активность, связанная с усилением противоопухолевого действия (Antineoplastic enhancer) (9b, c, 10a, c, 11c).
2. Лечение атеросклероза (Atherosclerosis treatment) вместе с ингибированием котранспортера натрия/желчных кислот (Sodium/bile acid cotransporter inhibitor) — 7b, 8с.
3. Противоязвенный эффект (Antiulcerative) вместе с антацидным (Antacid) и цитопротекторным действием (Cytoprotectant) — 7a, c.

Наибольший интерес представляет таутомер 15b с прогнозом средней вероятности лечения нейродегенеративных заболевании, в особенности болезни Альцгеймера с предсказанными механизмами действия — ингибирование агрегации β амилоида и прогнозируемым антимиелогенным эффектом.

Представляется важным, что для соединений 7–16 не прогнозируется ингибирование основных ферментов метаболизма. Для некоторых соединений прогнозируется индуцирование цитохромов CYP 2B6 (7a, 8a, 11a, 14a) и CYP 2C19 (7a, 8a, 10a, 11a, 13a, 14a, 15a, d). Таутомеры 7b, c, по данным расчетов, могут являться субстратами GST A1-1, а таутомеры 9b, c — субстратами GST A с величиной Pa>0,5.

Для ряда таутомерных форм исследованных соединений с вероятностью Pa от 0,3 до 0,4 прогнозируется ингибирование фосфофруктокиназы-1 (Phosphofructokinase-1 inhibitor) — 7a, 9a, b, c, 15d (действие на антимишени). Такое взаимодействие может вызывать гемотоксический эффект (Hematotoxic) и гемолитическую анемию (Anemia, hemolytic), которые вместе с действием фосфофруктокиназы-1 прогнозируются в интервале Pa от 0,3 до 0,6 (соединения 9a, b, 13d, 16a, d). Таутомерные формы b, c соединения 9 отличаются прогнозом ингибирования ДНК полимеразы беты и, как следствие, возможными побочными эффектами в виде периферийной нейропатии и панкреотитом.

После экспериментального подтверждения наличия указанных взаимодействий, соответствующие таутомеры/соединения могут быть исключены из дальнейших исследований.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенное комплексное исследование, включающее квантово-химический анализ и прогноз спектра биологической активности in silico для ряда N-сульфопропилированных производных урацила (7–16) и их таутомерных форм, позволило выявить ряд закономерностей, важных как для понимания структурной динамики этих соединений, так и для их дальнейшей направленной модификации в поиске новых терапевтических агентов, в том числе — для лечения заболеваний ЦНС.

Таутомерные предпочтения в конденсированной фазе.
Ключевым результатом квантово-химических расчетов является выраженное доминирование дикето-таутомера а для всех исследованных соединений, а также для незамещенного урацила. Относительная энергия Гиббса для таутомера а принята за ноль, а для форм b и c изменяется в широком диапазоне от 36 до 122 кДж/моль в зависимости от природы заместителя (табл. 1). Наиболее близкими к дикето-форме по энергии оказались таутомеры b (например, для 7b: ΔΔG = 38.0 кДж/моль, для 14b: 36.0 кДж/моль), тогда как диенольные формы d и e значительно менее стабильны (ΔΔG достигает 125 кДж/моль). Полученный результат согласуется с классическими представлениями о преобладании лактамных форм пиримидинов в полярных средах и дополнительно подтверждает, что введение сульфопропильной группы в положение N1 (как в соединениях 7–13) или N3 (для 14–16) не меняет таутомерных предпочтений пиримидинового каркаса. Более того, полученные значения ΔΔG для урацила (U1 vs U2 — 60.3 кДж/моль, U1 vs U3 — 46.2 кДж/моль) хорошо коррелируют с литературными данными (разница ~11–19 ккал/моль ≈ 46–79 кДж/моль) [10]. Таким образом, для всех практических целей в физиологических условиях (водная среда, pH 7.4) можно ожидать, что соединения 7–16 будут находиться преимущественно в дикето-форме а, и именно эта форма должна рассматриваться в качестве основной при интерпретации биологических тестов и молекулярном моделировании.

Влияние заместителей на стабильность таутомеров.
Хотя выявленная общая иерархия стабильности таутомеров (a > b > c) сохраняется для всех соединений, величины относительных энергий заметно варьируют (табл. 1). Наибольшая стабилизация кето-енольной формы b относительно дикето-формы наблюдается у соединения 14 (ΔΔG = 36.0 кДж/моль) — это 6-аминопроизводное, в котором аминогруппа в положении 6 может образовывать внутримолекулярную водородную связь с карбонильной группой C4 в енольной форме. Напротив, для 5-амино- (15) и 5,6-диаминопроизводных (16) разница больше (42.8 и 91.5 кДж/моль, соответственно), что объясняется стерическими и электронными эффектами. Для галогенпроизводных (10 — Br, 11 — Cl) форма b также менее стабильна, чем в незамещенном урациле (ΔΔG ~45– 50 кДж/моль против 38 кДж/моль для 7b), что указывает на дестабилизирующее влияние электроноакцепторных заместителей на кето-енольный таутомер. Обращает на себя внимание соединение 9 (5-нитропроизводное): здесь разница между 9a и 9b составляет 38.5 кДж/моль, что сопоставимо с незамещенным урацилом.

Ранее в литературе сообщалось о сильной стабилизации диенольного таутомера в 5-нитроурациле за счет внутримолекулярной водородной связи NO···HO, приводящей к снижению разницы энергий до ~22 кДж/ моль [10]. В наших расчетах для 9c (диенольная форма C2-OH, C4-OH) ΔΔG = 67.0 кДж/моль, что значительно выше. Наблюдаемое расхождение может быть связано с тем, что в работе [10] оценивалась полная диенольная форма с возможной дополнительной стабилизацией, тогда как изученные нами соединения содержат лишь один енольный фрагмент. Тем не менее, полученные данные показывают, что даже сильные акцепторные заместители не меняют глобального таутомерного равновесия в конденсированной среде.

Прогноз биологической активности in silico: основные эффекты и их зависимость от таутомерии.
Анализ спектра предсказанных активностей (табл. 2) показывает, что наиболее выраженным и воспроизводимым для большинства таутомеров является противовирусный эффект с Pa до 0.890 (для 12a). Особого внимания заслуживает сочетание противовирусной активности с ингибированием ДНК-направленной ДНК-полимеразы, которое с высокой вероятностью прогнозируется для таутомеров 8a, 10a, 11a, 12a, 13a, 14a (Pa > 0.55). Это прямо указывает на возможный механизм действия, аналогичный известным антиметаболитам (цитарабин, идоксуридин), и позволяет рассматривать соединения рядов 14 (5-метилурацил, тимин) и 13 (бромпроизводное) как перспективные основы для разработки новых противовирусных препаратов, в том числе активных в отношении ВИЧ (Pa > 0.8 для 8a и 13a). Интересно, что для аминопроизводных 14–16 эта активность существенно ниже (Pa < 0.6), что, вероятно, связано, среди прочего, с изменением электронной плотности в гетероцикле и нарушением способности к образованию водородных связей с активным центром полимеразы.

Сравнение разных таутомерных форм показывает, что в исследованных сериях наиболее вероятная противовирусная активность приходится на дикето-форму а и в некоторых случаях на форму с (например, 8c Pa = 0.766), тогда как форма b во всех случаях дает более низкие значения Pa. Это может свидетельствовать о важности сохранения двух карбонильных групп для связывания с мишенью. Для соединений 14–16 (аминопроизводные) таутомер а также предпочтителен, но его абсолютные величины Pa ниже. Таким образом, при планировании дальнейших исследований следует ориентироваться на дикето-форму, которая, с высокой вероятностью, и будет реально существовать в водной среде.

Помимо противовирусной активности, прогнозируются антибактериальный эффект (особенно офтальмологический, Pa до 0.648), противоишемическое действие (Pa до 0.564) и гепариноподобная активность. Примечательно, что для таутомера 15b предсказано лечение нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера) с механизмом ингибирования агрегации β-амилоида (Pa = 0.442) и антиамилоидогенный эффект (Pa = 0.349). Учитывая указанную выше направленность наших исследований на поиск нейропротекторов, это соединение заслуживает первоочередного экспериментального изучения в моделях болезни Альцгеймера. Однако следует иметь в виду, что 15b является кето-енольным таутомером, относительная энергия которого на 42.8 кДж/моль выше, чем у стабильной дикето-формы 15a. В физиологических условиях равновесная концентрация 15b будет невелика (~ 10^–7), что может лимитировать его фармакологический эффект. Возможно, последний может реализоваться в процессе обратимого таутомерного перехода, или же активность будет проявлять дикето-форма, а предсказание для таутомера 15b отражает структурное сходство с активным конформером. Этот вопрос требует дополнительного изучения методами молекулярного докинга.

Анализ побочных эффектов и токсичности на основе прогноза взаимодействия с антимишенями и ферментами метаболизма.
Для большинства соединений не ожидается ингибирования основных изоформ цитохрома P450 (CYP), однако индукция CYP2B6 и CYP2C19 предсказана для таутомеров 7a, 8a, 10a, 11a, 13a, 14a, 15a, d (Pa 0.51–0.59). Это может приводить к лекарственным взаимодействиям при одновременном применении с субстратами этих ферментов. Кроме того, для ряда таутомеров (9a, b, 13d, 16a, d) прогнозируется гемотоксический эффект (Pa до 0.43) и гемолитическая анемия, обусловленная вероятным ингибированием фосфофруктокиназы-1. Особого внимания заслуживают таутомеры 9b, c, для которых дополнительно предсказаны ингибирование ДНК-полимеразы β (Pa = 0.414) и периферическая нейропатия (Pa = 0,431). Соединения с нитрогруппой в положении 5 (9) следует подвергнуть тщательной токсикологической оценке. Аналогично, для таутомеров 9b, c предсказан риск панкреатита (Pa ~0,48), что согласуется с известной токсичностью нитроароматических соединений.

ВЫВОДЫ

Совокупный анализ собственных экспериментальных данных и мировых тенденций в медицинской химии азотистых гетероциклов позволяет заключить, что производные урацила, в особенности содержащие сульфоалкильные группировки и аминогруппы, обладают значительным и далеко не полностью раскрытым потенциалом для разработки инновационных терапевтических препаратов. Выполненное исследование выявило зависимость между таутомерным строением N-сульфопропилированных урацилов и их предсказанной биологической активностью. Доминирование дикето-формы а в конденсированной среде упрощает интерпретацию SAR и позволяет использовать одну низкоэнергетическую конформацию для молекулярного моделирования. Прогнозы PASS указывают на ряд многообещающих активностей, особенно противовирусной и антиамилоидогенной, но требуют экспериментального подтверждения.